Valgu puhastamise meetodid biotehnoloogias

Biotehnoloogia uuringute oluline komponent on valgu inseneritehnikate kasutamine valkude kavandamiseks või modifitseerimiseks. Need valgu puhastamise tehnikad optimeerivad valkude omadusi konkreetsetes tööstuslikes rakendustes.

Need meetodid nõuavad teadlastelt huvipakkuvate valkude isoleerimist ja puhastamist, et oleks võimalik uurida nende konformatsioone ja substraadi eripära. Uuringut vajavad ka reaktsioonid teiste liganditega (valk, mis kinnitub retseptori valgule) ja spetsiifilised ensüümide aktiivsused.

Vajalik valgu puhtuseaste sõltub valgu kavandatud lõpptarbimisest. Mõne rakenduse jaoks piisab töötlemata ekstraktist. Muu kasutamine, näiteks toiduainetes ja farmaatsiatoodetes, on vajalik kõrge puhtusastmega toode. Mitu tehnikat valgu puhastamine kasutatakse vajaliku puhtusastme saavutamiseks.

Iga valgu puhastamise etapp põhjustab tavaliselt teatud määral toote kadu. Seetõttu on ideaalne valgu puhastamise strateegia selline, kus kõrgeim puhastustase saavutatakse võimalikult vähese sammuga.

Kasutatavate etappide valik sõltub sihtvalgu suurusest, laengust, lahustuvusest ja muudest omadustest. Järgmised tehnikad on kõige sobivamad ühe tsütosoolse valgu puhastamiseks.

Tsütosoolsete valgukomplekside puhastamine on keerulisem ja nõuab tavaliselt erinevate meetodite kasutamist.

Rakusiseste (rakusiseste) valkude puhastamise esimene samm on toorekstrakti valmistamine. Ekstrakt sisaldab raku tsütoplasmas sisalduvate valkude keerukat segu ja veel mõningaid makromolekule, kofaktoreid ja toitaineid.

Seda toorekstrakti võib kasutada biotehnoloogia mõnedes rakendustes. Kui aga tegemist on puhtusega, tuleb järgida järgmisi puhastamisetappe. Toorproteiini ekstraktid valmistatakse kemikaalide abil rakkude lüüsimisel tekkinud rakujäätmete eemaldamise teel, ensüümid, ultrahelitöötlus või Prantsuse ajakirjandus.

Prügi eemaldatakse tsentrifuugimisega ja supernatant (vedelik tahke jäägi kohal) eraldatakse. Rakuväliste (rakuväliste) valkude toorprodukte võib saada rakkude lihtsalt tsentrifuugimise teel eemaldamise teel.

Kindlasti biotehnoloogia Rakenduste kasutamisel on nõudlus termostabiilsete ensüümide järele - ensüümid, mis taluvad kõrgeid temperatuure ilma denatureerimata, säilitades samal ajal kõrge eriaktiivsuse.

Kuumuskindlaid valke tootvaid organisme nimetatakse mõnikord ekstremofiilideks. Kuumakindla valgu puhastamiseks on lihtne kasutada segu teiste valkude denatureerimist kuumutatakse, jahutatakse seejärel lahus (võimaldades seega termostabiilsel ensüümil reageerida või uuesti lahustuda, kui vajalik). Seejärel saab denatureeritud valke tsentrifuugimise teel eemaldada.

Kaasaegne biotehnoloogia protokollides kasutatakse sageli ära paljusid müügil olevaid komplekte või meetodeid, mis pakuvad valmislahendusi standardprotseduuridele. Valgu puhastamine toimub sageli filtrite ja ettevalmistatud geelfiltratsioonikolonni abil.

Järgige dialüüsikomplekti juhiseid ja lisage õige lahuse maht ning oodake kindlaksmääratud aja jooksul eluendi (lahusti läbinud kolonni) kogumisel värskes katses toru.

Kromatograafilisi meetodeid saab kasutada pealiskolonni või automatiseeritud HPLC-seadme abil. Eraldamist HPLC abil saab teha pöördfaasi, ioonvahetuse või suuruseraldusmeetoditega ning proovid tuvastatakse dioodimassiivi või lasertehnoloogia abil.

Varem oli valgu puhastamata ekstraktist puhastamise tavaline teine ​​samm sadestamine suure osmootse tugevusega lahuses (st soolalahused). Valkude sadestamine toimub tavaliselt soolana ammooniumsulfaadi abil. Tooriekstraktis olevad nukleiinhapped saab eemaldada streptomütsiin- või protamiinsulfaadiga moodustunud agregaatide sadestamise teel.

Soola sadestumine ei põhjusta tavaliselt kõrgelt puhastatud valku, vaid see võib aidata segust eemaldada mõned soovimatud valgud ja proovi kontsentreerida. Seejärel eemaldatakse lahuses olevad soolad dialüüsi teel poorse tselluloositoru, filtrimise või geelkromatograafia abil.

Erinevad valgud sadestuvad ammooniumsulfaadi erinevates kontsentratsioonides. Üldiselt sadestuvad suurema molekulmassiga valgud madalamates ammooniumsulfaadi kontsentratsioonides.

Pöördfaasikromatograafia (RPC) eraldab valgud nende suhtelise hüdrofoobsuse põhjal (mittepolaarsete molekulide välistamine veest). See meetod on väga selektiivne, kuid nõuab orgaaniliste lahustite kasutamist.

Osa valke denatureerivad lahustid püsivalt ja kaotavad RPC ajal funktsionaalsuse. Seetõttu ei soovitata seda meetodit kasutada kõigis rakendustes, eriti kui sihtvalk on vajalik aktiivsuse säilitamiseks.

Ioonivahetuskromatograafia viitab valkude eraldamisele laengu alusel. Kolonne saab valmistada kas aniooni- või katioonvahetuseks. Anioonvahetuskolonnid sisaldavad statsionaarset faasi positiivse laenguga, mis meelitab ligi negatiivselt laetud valke.

Katioonivahetuskolonnid on vastupidised, negatiivselt laetud helmed, mis meelitavad positiivselt laetud valke. Sihtvalgu (valkude) elueerimine (ühe materjali ekstraheerimine) viiakse läbi, muutes pH väärtust kolonni, mille tulemuseks on iga laetud funktsionaalrühma muutmine või neutraliseerimine valk.

Suuruseralduskromatograafia (tuntud ka kui geelfiltratsioon) eraldab suuremad valgud väiksematest kuna suuremad molekulid läbivad kromatograafias ristseotud polümeeri kiiremini veerg. Suured valgud ei mahu polümeeri pooridesse, samas kui väiksemad valgud kulutavad kromatograafiakolonnist vähem otsese marsruudi läbimiseks kauem.

Eluaat (elueerimise tulemus) kogutakse katseklaaside sarja, mis eraldavad valgud elueerimise aja alusel. Geeli filtreerimine on kasulik vahend valguproovi kontsentreerimiseks, kuna sihtvalk kogutakse väiksema elueerimise mahuga, kui algselt kolonni lisati. Sarnaseid filtreerimistehnikaid võidakse suuremahulise valgu tootmise ajal kasutada nende kulutasuvuse tõttu.

Afiinsuskromatograafia on väga kasulik meetod "poleerimiseks" või valgu puhastamise protsessi lõpuleviimiseks. Kromatograafiakolonnis olevad helmed on ristseotud ligandidega, mis seonduvad spetsiifiliselt sihtvalguga.

Seejärel eemaldatakse valk kolonnist, loputades lahusega, mis sisaldab vabu ligande. See meetod annab muude meetoditega võrreldes kõige puhtamad tulemused ja kõrgeima spetsiifilise aktiivsuse.

SDS-PAGE (naatriumdodetsüülsulfaat, mida kasutatakse koos polüakrüülamiidi geelelektroforeesiga) seondub valkudega, andes neile suure negatiivse netolaengu. Kuna kõigi valkude laengud on üsna võrdsed, eraldab see meetod need peaaegu täielikult suuruse põhjal.

SDS-PAGE-d kasutatakse sageli valgu puhtuse testimiseks pärast seeria iga etappi. Kuna soovimatud valgud eemaldatakse segust järk-järgult, väheneb SDS-PAGE geelil visualiseeritud ribade arv, kuni soovitud valku on ainult üks riba.

Immunoblotanalüüs on valkude visualiseerimise tehnika, mida rakendatakse koos afiinsuskromatograafiaga. Konkreetse valgu antikehi kasutatakse afiinsuskromatograafia kolonnis ligandidena.

Sihtvalk hoitakse kolonnis, seejärel eemaldatakse see kolonni loputamisega soolalahuse või muude ainetega. Radioaktiivsete või värvainete märgistega seotud antikehad aitavad sihtvalku tuvastada, kui see on ülejäänud segust eraldatud.