Kuidas polümeraasi ahelreaktsioon toimib geenide võimendamiseks

polümeraasi ahelreaktsioon (PCR) on molekulaargeneetiline tehnika geenist mitme koopia tegemiseks ja on samuti osa geenide sekveneerimisprotsessist.

Geenikoopiad tehakse DNA proovi abil ja tehnoloogia on piisavalt hea, et teha proovis leitud geeni ühest koopiast mitu koopiat. Geeni PCR amplifikatsioon miljonite koopiate tegemiseks võimaldab tuvastada ja tuvastada geenijärjestusi visuaalsete tehnikate abil, mis põhinevad DNA tüki suurusel ja laengul (+ või -).

Kontrollitud tingimustes genereerivad DNA polümeraasidena tuntud ensüümid, mis lisavad täiendavaid desoksünukleotiide. (dNTP-d) DNA tükile, mida nimetatakse "matriitsiks". Isegi väiksemaid DNA tükke, mida nimetatakse "praimeriteks", kasutatakse lähtepunktina polümeraas.

Praimerid on väikesed inimtekkelised DNA tükid (oligomeerid), tavaliselt 15–30 nukleotiidi pikkused. Need tekivad amplifitseeritava geeni kõige otstes olevate lühikeste DNA järjestuste tundmise või aimamise teel. PCR ajal sekveneeritavat DNA-d kuumutatakse ja kaksikahelad eralduvad. Jahtumisel seostuvad praimerid malliga (nimetatakse anniilimiseks) ja loovad koha polümeraasi alustamiseks.

Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR) sai võimalikuks termofiilide ja termofiilsete ainete avastamise tõttu polümeraasi ensüümid (ensüümid, mis säilitavad pärast kõrgel kuumutamisel struktuuri terviklikkuse ja funktsionaalsuse temperatuurid). PCR tehnika etapid on järgmised:

• Luuakse segu DNA matriitsi, polümeraasi ensüümi, praimerite ja dNTP-de optimeeritud kontsentratsioonidega. Võimalus soojendada ensüümi denatureerimata segu võimaldab denatureerida DNA proovi kaksikheeliksit temperatuurivahemikus 94 kraadi Celsiuse järgi.
• Pärast denatureerimist jahutatakse proov mõõdukama vahemikuni, umbes 54 kraadini, mis hõlbustab praimerite anniilimist (seondumist) üheahelaliste DNA mallidega.
• Tsükli kolmandas etapis soojendatakse proovi uuesti temperatuurini 72 kraadi, mis on Taq DNA polümeraasi jaoks ideaalne temperatuur pikendamiseks. Elongatsiooni ajal kasutab DNA polümeraas täiendavate dNTP-de lisamiseks mallina DNA algset üksikut ahelat. iga praimeri 3' otstesse ja genereerida huvipakkuva geeni piirkonnas kaheahelalise DNA osa.
• Praimerid, mis on anniilinud DNA järjestustega, mis ei kattu täpselt, ei jää anniilituks 72 kraadi juures, piirates seega huvipakkuva geeni pikenemist.

Seda denatureerimise, anniilimise ja pikendamise protsessi korratakse mitu (30–40) korda, suurendades seeläbi plahvatuslikult soovitud geeni koopiate arvu segus. Kuigi see protsess oleks käsitsi teostamisel üsna tüütu, saab proove ette valmistada ja inkubeerida a programmeeritav Thermocycler, mis on nüüdseks enamikus molekulaarlaborites tavaline, ja täieliku PCR-reaktsiooni saab läbi viia 3-4 tundi.

Iga denatureerimisetapp peatab eelmise tsükli pikenemise, kärpides seega uue DNA ahela ja hoides selle ligikaudu soovitud geeni suuruses. Pikendustsükli kestust saab muuta pikemaks või lühemaks sõltuvalt huvipakkuva geeni suurusest, kuid lõpuks korduvate tsüklite kaudu. PCR, on enamik malle piiratud ainult huvipakkuva geeni suurusega, kuna need on loodud mõlema geeni saadustest. praimerid.

Neid on mitu erinevat Eduka PCR-i tegurid mida saab tulemuste parandamiseks manipuleerida. Kõige laialdasemalt kasutatav meetod PCR-produkti olemasolu testimiseks on agaroosgeeli elektroforees. Mida kasutatakse DNA fragmentide eraldamiseks suuruse ja laengu alusel. Seejärel visualiseeritakse fragmendid värvainete või radioisotoopide abil.

Alates PCR avastamisest on avastatud teisi DNA polümeraase peale algse Taqi. Mõnel neist on parem korrektuur või need on kõrgematel temperatuuridel stabiilsemad, parandades seega PCR-i spetsiifilisust ja vähendades vale dNTP sisestamisel tekkivaid vigu.

Mõned PCR-i variatsioonid on loodud spetsiifiliste rakenduste jaoks ja neid kasutatakse nüüd regulaarselt molekulaargeneetika laborites. Mõned neist on reaalajas PCR ja pöördtranskriptaasi PCR. PCR avastamine on viinud ka DNA järjestuse väljatöötamiseni, DNA sõrmejälgede võtmine ja muud molekulaarsed tehnikad.