DNA amplifikatsioon polümeraasi ahelreaktsiooni kaudu

PCR tähistab polümeraasi ahelreaktsioon, molekulaarbioloogia tehnika DNA segmentide võimendamiseks, genereerides kontrollitud tingimustes DNA polümeraasi ensüümide abil mitu koopiat. DNA-lõigu või geeni ühe eksemplari saab kloonida miljonitesse koopiatesse, mis võimaldab värvainete ja muude visualiseerimistehnikate abil tuvastada.

1983. aastal välja töötatud PCR-protsess on teinud selle teostamise võimalikuks DNA järjestamine ja tuvastada nukleotiidide järjekord üksikutes geenides. Meetodis kasutatakse DNA sulamiseks ja replikatsiooniks termilist tsüklit või reaktsiooni korduvat kuumutamist ja jahutamist. PCR-i jätkudes kasutatakse replitseerimiseks matriitsina “uut” DNA-d ja toimub ahelreaktsioon, amplifitseerides DNA matriitsi eksponentsiaalselt.

PCR-meetodeid kasutatakse paljudes biotehnoloogia valdkondades, sealhulgas valguehitus, kloonimine, kohtuekspertiis (DNA-sõrmejälgede võtmine), isadustestid, pärilike ja / või nakkushaiguste diagnoosimine ja analüüs keskkonnaproovide arv.

Eelkõige on kriminalistikas PCR eriti kasulik, kuna see võimendab isegi kõige väiksemat kogust DNA tõendeid. PCR-i saab kasutada ka tuhandete aastate vanuse DNA analüüsimiseks ja neid tehnikaid on kasutatud kõige tuvastamiseks alates 800 000-aastasest mammutist kuni muumiateni kogu maailmast.

See samm on vajalik ainult DNA polümeraaside jaoks, mis vajavad kuumkäivituse PCR-i. Reaktsioonisegu kuumutatakse temperatuurini 94 kuni 96 ° C ja hoitakse 1-9 minutit.

Kui protseduur ei vaja lähtestamist, on esimene samm denaturatsioon. Reaktsiooni kuumutatakse temperatuuril 94-98 ° C 20-30 sekundit. DNA matriitsi vesiniksidemed katkevad ja luuakse üheahelalised DNA molekulid.

Reaktsiooni temperatuur on madalam vahemikus 50 kuni 65 ° C ja hoitakse 20-40 sekundit. Praimerid lõõmutavad üheahelalise DNA matriitsi. Temperatuur on selle sammu ajal äärmiselt oluline. Kui see on liiga kuum, ei pruugi krunt siduda. Kui see on liiga külm, võib krunt siduda ebatäiuslikult. Hea sidumine moodustub siis, kui praimerijärjestus vastab täpselt matriitsijärjestusele.

Selle etapi temperatuur varieerub sõltuvalt polümeraasi tüübist. DNA polümeraas sünteesib täiesti uue DNA ahela.

See etapp viiakse läbi temperatuuril 70-74 ° C 5-15 minutit pärast viimast PCR-tsüklit.

See samm on valikuline. Temperatuuri hoitakse vahemikus 4-15 ° C ja reaktsioonisegu jälgitakse.

Igas tsüklis toode (konkreetne replitseeritav DNA tükk) kahekordistub.

Kuna DNA polümeraas kaotab aktiivsuse ja tarbib reagente, aeglustub reaktsioon.

Rohkem toodet ei kogune.