Restriktsiooni endonukleaasid on klass ensüüm mis lõikavad DNA molekule. Iga ensüüm tunneb ära DNA ahela unikaalsed nukleotiidide järjestused - tavaliselt umbes neli kuni kuus aluspaari. Järjestused on palindoomsed, kuna komplementaarsel DNA ahelal on sama järjestus vastupidises suunas. Teisisõnu, mõlemad DNA ahelad lõigatakse samasse kohta.
Kust neid ensüüme leitakse
Restriktsiooniensüüme leidub paljudes erinevates bakteritüvedes, kus nende bioloogiline roll on osaleda raku kaitses. Need ensüümid piiravad rakkudesse sisenevat võõrast (viiruslikku) DNA-d, hävitades need. Peremeesrakkudel on restriktsiooni modifitseerimise süsteem, mis metüülib nende endi DNA nende restriktsiooniensüümide spetsiifilistes kohtades, kaitstes seeläbi neid lõhustumise eest. Rohkem kui 800 tuntud ensüümid on avastatud enam kui 100 erinevat nukleotiidijärjestust.
Piiravate ensüümide tüübid
Seal on viis erinevat tüüpi restriktsiooniensüüme. I tüüp lõikab DNA juhuslikes kohtades tuvastamiskohast kuni 1000 või enam aluspaari. III tüüpi jaotustükid asuvad kohast umbes 25 aluspaari kaugusel. Mõlemad tüübid vajavad ATP-d ja need võivad olla suured mitme subühikuga ensüümid. II tüübi ensüümid, mida kasutatakse peamiselt biotehnoloogias, lõikavad DNA tunnustatud järjestuses, ilma et oleks vaja ATP-d, ning on väiksemad ja lihtsamad.
II tüüpi restriktsiooniensüüme nimetatakse bakteriliikide järgi, millest nad eraldati. Näiteks eraldati E-st ensüüm EcoRI. coli. Enamik avalikkust on E-ga tuttavad. coli puhangud toidus.
II tüüpi restriktsiooniensüümid võivad genereerida kahte erinevat tüüpi jaotustükke sõltuvalt sellest, kas nad lõikavad mõlemad ahelad äratundmisjärjestuse keskpunktis või iga ahel on äratundmise ühele otsale lähemal jada.
Endine lõige tekitab nüri otsad ilma nukleotiidide üleulatuvate osadeta. Viimane loob "kleepuvaid" või "sidusaid" otsi, kuna igal saadud DNA fragmendil on ülejääk, mis täiendab teisi fragmente. Mõlemad tooted on molekulaargeneetikas kasulikud rekombinantne DNA ja valgud. See DNA vorm paistab silma seetõttu, et see saadakse kahe või enama erineva ahela, mis algselt polnud omavahel seotud, ligeerimisega (sideme moodustamisega).
IV tüüpi ensüümid tunnevad metüleeritud DNA-d ära ja V-tüüpi ensüümid kasutavad RNA-sid, et lõigata järjestusi sissetungijatele organismidele, mis pole palindroomsed.
Kasutamine biotehnoloogias
Restriktsiooniensüüme kasutatakse biotehnoloogias DNA lõikamiseks väiksemateks ahelateks, et uurida fragmentide pikkuse erinevusi indiviidide vahel. Seda nimetatakse restriktsioonifragmentide pikkuse polümorfismiks (RFLP). Neid kasutatakse ka geenide kloonimisel.
RFLP tehnikad Neid on kasutatud selleks, et teha kindlaks, kas indiviididel või indiviidide rühmadel on genoomi teatud piirkondades selgelt eristatavad geenijärjestused ja restriktsioonilõikamismustrid. Nende ainulaadsete piirkondade tundmine on aluseks DNA sõrmejäljed. Kõik need meetodid sõltuvad meetodi kasutamisest agaroosgeeli elektroforees DNA fragmentide eraldamiseks. Agaroosgeeli jaoks kasutatakse tavaliselt TBE puhvrit, mis koosneb Tris-alusest, boorhappest ja EDTA-st elektroforees uurida DNA tooteid.
Kasutamine kloonimisel
Kloonimine nõuab sageli geeni sisestamist plasmiidi, mis on teatud tüüpi DNA tükk. Restriktsiooniensüümid võivad protsessile kaasa aidata üheahelaliste üleulatuvate osade tõttu, mis nad lahkudes lahkuvad. DNA ligaas, eraldi ensüüm, võib ühendada kaks sobivate otstega DNA molekuli.
Niisiis, kasutades DNA ligaasi ensüümidega restriktsiooniensüüme, saab ühe DNA molekuli loomiseks kasutada erinevatest allikatest pärit DNA tükke.