Kaks keskset tähemärki Hiirtest ja meestest on George Milton ja Lennie Small, kaks võõrtöötajat, kes otsisid Lõuna-Californias 1930. aastatel põllumajandustöid. Kui raamat algab, on George ja Lennie jõudnud just uude rantšosse; seal kohtuvad George ja Lennie ning nende kaudu ka lugejad - põnevad tegelaskujud.
Lennie väike
Lennie Small on suur, leebe südamega võõrtöötaja, kellel on vaimupuue. Ta usaldab juhendamist ja ohutust George Miltoni, oma eluaegse sõbra ja kaas võõrtöötaja poole. George'i juuresolekul taunib Lennie oma autoriteetset sõpra, kuid kui George'i pole, räägib Lennie vabamalt. Mõnikord laseb ta libiseda teavet, mida George käskis tal saladuses hoida, nagu nende plaan osta maatükk.
Lennie armastab puudutada midagi pehmet, alates riidest kuni hiire karusnahani kuni naise karvani. Ta on klassikaline õrn hiiglane, kes ei taha kunagi kahju tekitada, kuid tema füüsiline jõud viib tahtmatult hävitamiseni. George'ilt saame teada, et tema ja Lennie pidid oma viimasest talust lahkuma, kuna Lennie ei suutnud hoiduda naise riietuse puutumisest ja teda süüdistati lõpuks vägistamises. Kui Lennie saab kutsika ühelt teiselt põllutöötajalt kingitusena, tapab ta selle kogemata liiga tugevalt hellitades. Lennie suutmatus oma füüsilist jõudu ohjeldada põhjustab mõlemale mehele probleeme, eriti kui ta tapab kogemata Curley naise.
George Milton
George Milton on Lennie domineeriv juht ja lojaalne kaitsja. Kaks meest kasvasid koos, kuid George avaldab sõpruses suuremat autoriteeti Lennie sõltuvuse tõttu.
George ja Lennie räägivad sageli oma maa saamisest. Näib, et Lennie võtab seda plaani väga tõsiselt, kuid George'i pühendumus pole nii selge. Näiteks selle asemel, et tulevikus maa ostmiseks raha kokku hoida, puhub George oma säästud ühe ööga baaris käies.
George kurdab vahel oma hoolitseva rolli üle, kuid ta on kindlalt pühendunud Lennie otsimisele. Tema mõttekäiku ei selgitata aga kunagi selgelt. Võib juhtuda, et George jääb Lennie juurde, sest suhe annab talle autoriteeditunde, kui tema elul puudub muidu enesemääratlus. Tõenäoliselt lohutab ta ka Lennie tuttavat, kuna kaks meest reisivad regulaarselt ega pane kunagi suurt osa nõudest kuhugi.
Pärast seda, kui Lennie tappis kogemata Curley naise, valib George Lennie. Otsus on armuakt, et säästa oma sõpra kannatustest teiste põllutöötajate käes.
Curley
Curley on rantšo omaniku agressiivne lühikese kasvuga poeg. Ta astub farmis ringi autoriteetselt ja on kuulujutt, et ta on endine Kuldsete Kindade poksija. Curley kordab pidevalt kaklusi, eriti Lenniega; üks selline võitlus viib Lennie Curley kätt purustamiseni.
Curley kannab igal ajal oma kätel kindaid. Teised töötajad väidavad, et kinnas on kreemiga täidetud, et käsi tema naise jaoks õrn oleks. Curley on tegelikult oma naise suhtes väga armukade ja kaitsev ning kardab sageli, et ta flirdib teiste töötajatega. Pärast seda, kui Lennie tapab kogemata Curley naise, viib Curley teised töötajad mõrvarlikule uustulnuka jahile.
Kommid
Candy on vananev rantšo meistrimees, kes kaotas aastaid tagasi õnnetuses ühe käe. Nii puude kui ka vanuse tõttu muretseb Candy oma tuleviku pärast talus. Kui Lennie paljastab, et tema ja George plaanivad osta oma maad, tunneb Candy, et on saanud õnne ja ta pakub nende liitumiseks 350 dollarit. Candy, nagu Lennie, usub sellesse kavasse tõeliselt ja seetõttu suhtub ta mõistvalt George'i ja Lennie poole kogu novelli vältel, isegi ulatudes nii kaugele, et aidata George'il edasi lükata Lennie jaht Curley naise järel surm.
Kelmid
Crooks, kes sai oma hüüdnime oma valesti vallandamise tõttu, on stabiilne käsi ja ainus Aafrika-Ameerika töötaja rantšos. Oma rassi tõttu ei saa Crooks koos teiste töötajatega laudas elada. Crooks on kibe ja küüniline, kuid saab sellegipoolest hästi läbi Lenniega, kes ei jaga teiste töötajate rassismi.
Ehkki George on talle vannutanud saladuse hoidmise, teatab Lennie Crooksile, et plaanivad koos George'iga maad osta. Crooks väljendab sügavat skepsist. Ta räägib Lennie'le, et ta on kuulnud igasuguseid inimesi rääkimas kõikvõimalikest plaanidest, kuid tegelikult ei juhtunud neist kunagi ühtegi.
Hiljem samas stseenis läheneb Curley naine kahele mehele, vesteldes flirtivalt. Kui Crooks palub tal lahkuda, heidab Curley naine talle rassilisi epiteete ja väidab, et ta võis teda lüüa. Juhtum on alandav Crooksile, kes peab siis vabandama Curley naise ees Lennie ja Candy ees, hoolimata sellest, et tegemist on ülekohut teinud peoga.
Curley naine
Curley naine on noor ilus naine, kelle nime romaanis kunagi ei mainita. Tema abikaasa Curley on armukade ja umbusklik ning ta napsab teda sageli. Tal on armas külg, mida demonstreeritakse, kui ta räägib Lennie'le nii oma lapsepõlve unistustest filmistaarist kui ka julmast triibust, mida tõendab rassistlik verbaalne rünnak, mille ta Crooksis käivitas. Curley naine sadestab raamatu haripunkti, paludes Lenniel juukseid lüüa, mispeale Lennie ta tahtmatult tapab. Curley naine on vähem arenenud kui teised tegelased ja tundub, et ta teenib peamiselt süžeed edasi ja õhutab konflikti.