Põld biotehnoloogia on pidevas muutumises. Tipptasemel teadusuuringute kiire kasv ja areng sõltuvad innovatsioonist ja loovusest teadlased ja nende võime näha potentsiaali põhimolekulaartehnikas ja rakendada seda uutele protsessid. Polümeraasi ahelreaktsiooni tulek (PCR) avas geeniuuringutes palju uksi, sealhulgas vahendeid DNA analüüs ja erinevate geenide identifitseerimine nende DNA järjestuste põhjal. DNA järjestamine sõltub ka meie kasutamisvõimest geelelektroforees eraldada DNA ahelad, mille suurus erineb nii vähe kui üks aluspaar.
DNA järjestamine
1970. aastate lõpus leiutati pikemate DNA molekulide jaoks kaks DNA järjestamise tehnikat: Sangeri (või dideoksü) meetod ja Maxam-Gilberti (keemiline lõhestamine) meetod. Maxam-Gilberti meetod põhineb nukleotiidspetsiifilisel lõhustamisel kemikaalide abil ja seda saab kõige paremini kasutada oligonukleotiidide (lühikesed nukleotiidpolümeerid, tavaliselt alla 50 aluspaari pikkused) sekveneerimiseks. Sangeri meetodit kasutatakse sagedamini, kuna selle kasutamine on tehniliselt osutunud lihtsamaks ja koos PCR-i tulek ja tehnika automatiseerimine on hõlpsasti rakendatav pikkadele DNA ahelatele, kaasa arvatud mõned terved geenid. See meetod põhineb ahela katkestamisel dideoksünukleotiidide abil PCR pikenemisreaktsioonide ajal.
Sangeri meetod
Sangeri meetodis kasutatakse analüüsitavat DNA ahelat matriitsina ja DNA polümeraasi kasutatakse PCR reaktsioonis komplementaarsete ahelate genereerimiseks praimereid kasutades. Valmistatakse neli erinevat PCR reaktsioonisegu, millest igaüks sisaldab teatud protsenti dideoksünukleosiidtrifosfaadi (ddNTP) analooge neljast nukleotiidist (ATP, CTP, GTP või TTP).
Uue DNA ahela süntees jätkub, kuni üks neist analoogidest on inkorporeeritud, sel ajal ahel on enneaegselt kärbunud. Iga PCR reaktsioon sisaldab lõpuks erineva pikkusega DNA ahelate segu, mis kõik lõppeb nukleotiidiga, mis oli selle reaktsiooni jaoks dideoksü-märgistatud. Geel elektroforees Seejärel eraldatakse nelja reaktsiooni ahelad neljas eraldi reas ja eraldatakse algse matriitsi järjestus, lähtudes sellest, millised ahelate pikkused lõpevad millise nukleotiidiga.
Sangeri automatiseeritud reaktsioonis kasutatakse praimereid, mis on märgistatud nelja erinevat värvi fluorestsentsmärgisega. PCR-reaktsioonid viiakse läbi erinevate dideoksünukleotiidide juuresolekul, nagu eespool kirjeldatud. Järgmisena aga ühendatakse neli reaktsioonisegu ja kantakse geeli ühele rajale. Iga fragmendi värv tuvastatakse laserkiire abil ja teavet kogub arvuti mis genereerib kromatogrammid, millel on iga värvi piigid, millest matriits-DNA järjestus võib olla määratud.
Tavaliselt on automatiseeritud järjestamismeetod täpne ainult nende järjestuste puhul, mille pikkus on maksimaalselt umbes 700-800 aluspaari. Siiski on võimalik saada suuremate geenide täisjärjestusi ja tegelikult terveid genoome, kasutades järkjärgulisi meetodeid, nagu Primer Walking ja Shotgun sekveneerimine.
Praimeri kõndimisel sekveneeritakse suurema geeni toimiv osa Sangeri meetodil. Järjestuse usaldusväärsest segmendist genereeritakse uued praimerid ja neid kasutatakse geeni selle osa järjestuse määramiseks, mis jäi algsete reaktsioonide vahemikust välja.
Püstoli sekveneerimine tähendab huvipakkuva DNA segmendi juhuslikku lõikamist sobivaks (hallatava) suurusega fragmendid, järjestades iga fragmendi ja järjestades tükid kattumise põhjal järjestused. Seda tehnikat on hõlbustanud kattuvate osade paigutamiseks arvutitarkvara kasutamine.