Gram-värvimisprotseduur mikrobioloogias

Grami peits on diferentsiaalmeetod, mida kasutatakse määramiseks bakterid kahele rühmale (grampositiivne ja gramnegatiivne), mis põhineb nende rakuseinad. Seda tuntakse ka Grami värvimise või Grami meetodina. Protseduur on nimetatud tehnikat välja töötanud isiku, Taani bakterioloogi Hans Christian Grami järgi.

Protseduur põhineb peptidoglükaani vahelisel reaktsioonil mõne bakteri rakuseintes. Grami peits hõlmab bakterite värvimist, värvi fikseerimist pealispinnaga, rakkude värvitustamine ja pealiskihi pealekandmist.

1. Esmane plekk (kristallvioletne) seondub peptidoglükaaniga, värvides rakke lillaks. Nii grampositiivsetel kui ka gram-negatiivsetel rakkudel on rakuseintes peptidoglükaan, nii et esialgu värvivad kõik bakterid violetset värvi.
2. Grammi joodi (jood ja kaaliumjodiid) kasutatakse peptiidina või fikseerijana. Gram-positiivsed rakud moodustavad kristallviolet-joodi kompleksi.
3. Alkohol või rakkude värvitustamiseks kasutatakse atsetooni. Gramnegatiivsetel bakteritel on rakuseintes palju vähem peptidoglükaani, nii et see samm muudab need põhimõtteliselt värvituks, samal ajal kui grampositiivsetest rakkudest, milles on rohkem peptidoglükaani (60–90% raku seinast), eemaldatakse ainult osa värvist. Gram-positiivsete rakkude paks rakusein dehüdreeritakse värvitustamise etapis, põhjustades nende kokkutõmbumise ja lõksu-joodi kompleksi jäämise lõksu.
   instagram viewer
4. Pärast värvitustamise etappi kantakse bakter roosaks värvimiseks pealispinnaga (tavaliselt safraniin, kuid mõnikord ka fuksiin). Nii grampositiivsed kui ka gramnegatiivsed bakterid koristavad roosa peitsi, kuid grampositiivsete bakterite tumedama lilla kohal pole seda näha. Kui värvimisprotseduur viiakse läbi õigesti, on grampositiivsed bakterid lillad, gram-negatiivsed bakterid aga roosad.

Grami peitsimise tulemusi vaadatakse kasutades valgusmikroskoopiat. Kuna bakterid on värvilised, ei tuvastata mitte ainult nende Gram-petrühma nende kuju, suurus ja klompimismuster. See teeb Grami peitsi väärtuslikuks diagnostiliseks tööriistaks kliinikus või laboris. Kuigi plekk ei pruugi baktereid kindlasti tuvastada, piisab tõhusa antibiootikumi väljakirjutamisest sageli teadmisest, kas need on gram-positiivsed või gram-negatiivsed.

Mõned bakterid võivad olla grammimuutujad või grammi määramatud. Kuid isegi see teave võib olla kasulik bakterite identiteedi vähendamisel. Meetod on kõige usaldusväärsem, kui kultuurid on vähem kui 24 tundi vanad. Kuigi seda saab kasutada puljongikultuurides, on kõige parem neid kõigepealt tsentrifuugida. Tehnika peamine piirang on see, et kui tehnikas tehakse vigu, annab see ekslikke tulemusi. Usaldusväärse tulemuse saamiseks on vaja praktikat ja oskusi. Samuti ei pruugi nakkusetekitaja olla bakteriaalne. Eukarüootsed patogeenid värvivad gram-negatiivseid. Siiski enamus eukarüootsed rakud välja arvatud seened (sealhulgas pärm) ei suuda protsessi käigus slaidil kinni jääda.

• Kristallviolett (esmane plekk)
• Grami jood (peits, kristallvioleti kinnitamiseks rakuseinas)
• Etanool või atsetoon (värvaine)
• Safraniin (sekundaarne plekk või peits)
• Vesi pritspudelis või tilguti pudelis
• Mikroskoobi slaidid
• Liitmikroskoop

1. Pange objektiklaasile väike tilk bakteriproovi. Fikseerige bakterid objektiklaasile kuumutades seda kolm korda läbi Bunseni põleti leegi. Liiga suure kuumuse või liiga pika aja rakendamine võib bakteriraku seinu sulatada, moonutades nende kuju ja põhjustades ebatäpse tulemuse. Kui kuumust rakendatakse liiga vähe, peseb bakter värvimise ajal slaidi maha.
2. Kasutage tilga abil esmast pleki (kristallvioletti) slaidile ja laske sellel 1 minut seista. Loputage objektiklaasi õrnalt veega mitte kauem kui 5 sekundit, et eemaldada liigne plekk. Liiga pika loputusega võib eemaldada liiga palju värvi, samas kui liiga pika loputamise korral võib gram-negatiivsetele rakkudele jääda liiga palju plekki.
3. Kasutage tilguti abil Grami joodi slaidile, et kinnitada kristallviolett raku seina külge. Lase sel istuda 1 minut.
4. Loputage objektiklaasi alkoholi või atsetooniga umbes 3 sekundit, seejärel loputage kohe veega. Gram-negatiivsed rakud kaotavad värvi, samas kui gram-positiivsed rakud jäävad violetseks või siniseks. Kui aga värvieemaldaja jäetakse liiga pikaks ajaks, kaotavad kõik lahtrid värvi!
5. Kandke sekundaarne plekk safraniin ja laske sellel 1 minut seista. Loputage õrnalt veega mitte kauem kui 5 sekundit. Gramnegatiivsed rakud peaksid olema värvitud punaseks või roosaks, samas kui gram-positiivsed rakud on endiselt lillad või sinised.
6. Vaadake slaidi liitmikroskoobi abil. Lahtri kuju ja paigutuse eristamiseks võib olla vaja suurendada 500x kuni 1000x.

Mitte kõik grammi järgi tuvastatud bakterid pole haigustega seotud, kuid mõned olulised näited hõlmavad järgmist:

• Gram-positiivsed kokid (ümmargused):Staphylococcus aureus
• Gramnegatiivsed koktsid:Neisseria meningitidis
• Gram-positiivsed batsillid (vardad): Bacillus anthracis
• Gramnegatiivsed batsillid:Escherichia coli